Генетическая информация реализуется в результате трёх реакций матричного синтеза: репликации, транскрипции и трансляции. Во время репликации из одной молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) образуется 2 молекулы ДНК – копии исходной ДНК, тем самым происходит сохранение и передача точной информации из поколения в поколение. Транскрипция – процесс биосинтеза всех видов рибонуклеиновой кислоты (РНК) на соответствующих участках молекул ДНК. Трансляция – завершающий процесс реализации генетической информации, при котором происходит синтез белка на рибосомах с использованием матричной РНК (мРНК) в качестве матрицы.

Сегодня ДНК считают основным носителем генетической информации, однако в последние 30 лет становится все более очевидно, что очень большой объем генетической информации также локализован в некодирующих рибонуклеиновых кислотах (РНК), наиболее изученными из которых в настоящий момент являются микроРНК [1].

МикроРНК представляют собой эндогенные небольшие (21-23 нуклеотида) рибонуклеотиды, участвующие в регуляции процесса синтеза белка из аминокислот на базе матричной РНК (мРНК), то есть трансляции, как у растений, так и у животных [2]. МикроРНК участвуют в регуляции экспрессии большинства (>60%) генов, кодирующих белки у млекопитающих, в основном за счет ее подавления. Некоторые микроРНК экспрессируются повсеместно, другие же являются специфичными для определенных тканей и/или стадий развития организма [3].

Изменения как количества, так и функциональной активности микроРНК могут приводить к развитию различных заболеваний. В частности, было показано, что микроРНК играют важную роль в развитии онкологических, сосудистых заболеваний, ангиогенезе, апоптозе [4]. Также микроРНК обладают большим потенциалом как в качестве терапевтического агента, так и в качестве собственно мишени терапевтического воздействия.

Caenorhabditis elegans — свободноживущая нематода (круглый червь) длиной около 1 мм. Исследования этого вида в молекулярной биологии и биологии развития начались в 1974 работами S. Brenner [5]. Широко используется как модельный организм в исследованиях по генетике, нейрофизиологии, биологии развития, вычислительной биологии. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность генома (характерного для каждого вида организмов гаплоидного (одинарного) набора хромосом) была полностью определена и опубликована в 1998 году (дополнена в 2002).

Ambros и соавт. выяснили, что lin-4 – ген, контролирующий продолжительность личиночной стадии развития C. elegans, не кодирует никакого белка, а вместо этого продуцирует пару малых РНК [6]. Одна из РНК имела длину около 22 нуклеотидов, другая – около 61 нуклеотида. Предположительно, более длинная цепь, имеющая в своей вторичной структуре «шпильку» (структуру «стебель-петля»), являлась предшественницей более короткой (рис. 1).

Рисунок 1. «Стебель-петля» – элемент вторичной структуры РНК Figure 1. «Stem-loop» – an element of the secondary structure of RNA 

В лабораториях Ambros и Ruvkun обнаружили, что РНК гена lin-4 имеет антисмысловую комплементарность нескольким сайтам в 3’-нетранслируемой области гена lin-14 [6][7]. Ранее считалось, что эта комплементарность в 3’-конце отвечала за репрессию гена lin-14 посредством продукции гена lin-4 [8].

Однако в лаборатории Ruvkun было обнаружено, что непосредственно микроРНК lin-4 нацелена на подавление мРНК lin-14 (рис. 2), которая содержит семь консервативных комплементарных сайтов в 3'-нетранслируемой области [6,7,9]. Удаление же этих комплементарных сайтов у мутантов с усилением функции lin-14 или мутация с потерей функции в микроРНК lin-4 нарушает нормальное уменьшение белка lin-14, которое обычно начинается в середине первой личиночной стадии (L1) [7][8][10]. Так, впервые был продемонстрирован новый механизм подавления экспрессии с помощью антисмысловой РНК.

Рисунок 2. Механизм взаимодействия мРНК lin-14 и микроРНК lin-4 [11]

Синим цветом отмечена последовательность мРНК lin-14, красным отмечена последовательность микроРНК lin-4.a – цитоплазматический процессинг, в результате которого образуется микроРНК из пре-микроРНК (данный процесс подробно изложен далее).b – комплементарное соответствие микроРНК мРНК, вызывающее ингибирование трансляции

Figure 2. Mechanism of interaction between the lin-14 target mRNA and the lin-4 miRNA [11]

The lin-14 mRNA sequence is marked in blue, the lin-4 microRNA sequence is marked in red.a – cytoplasmic processing, as a result of which microRNA is formed from pre-microRNA (this process is described in detail below).b – complementary correspondence of microRNA to mRNA, causing translation inhibition

Более короткая цепь РНК lin-4 в настоящее время считается «основоположником» класса малых регулирующих РНК, называемых микроРНК [12][13][14]. В последнее время внимание многих ученых привлекает вопрос использования микроРНК как в качестве маркера различных заболеваний, так и как терапевтической мишени и агента [15-18].

В течение 7 лет после открытия РНК lin-4 геномика этого вида регуляторных РНК казалась довольно очевидной: никаких данных о наличии РНК, подобных РНК lin-4, или других подобных некодирующих РНК среди нематод получено не было. Всё изменилось после открытия let-7, другого гена C. elegans, кодирующего вторую 22-нуклеотидную регуляторную РНК. РНК let-7 отвечает за осуществление перехода C. elegans из поздней личиночной стадии во взрослую форму подобно тому, как РНК lin-4 отвечает за переход из первой личиночной стадии во вторую [19][20]. Кроме того, гомологи гена let-7 вскоре были идентифицированы в геноме человека и мухи, а РНК let-7 выделена у человека, мухи дрозофилы, а также 11 других видов двусторонне-симметричных животных [21].

Принимая во внимание схожесть ролей двуцепочечных РНК lin-4 и let-7 (относящимся к классу малых временных РНК – small temporal RNA (stRNA)) в регуляции продолжительности различных стадий развития живых организмов, вполне обоснованным было ожидать со временем открытие новых регуляторных РНК подобного типа [21]. И, в самом деле, менее чем через год три лаборатории, клонирующие малые РНК мух, червей и клеток человека, сообщили об идентификации в общей сложности более 100 дополнительных генов малых некодирующих РНК, в том числе 20 новых генов мухи дрозофилы, 30 – человека и около 60 – у червей [16-18]. РНК этих генов были похожи на малые временные РНК lin-4 и let-7 тем, что они представляли собой цепь из 22 нуклеотидов, синтезируемую на одном из плеч предшественника, имеющего в своей вторичной структуре элемент «стебель-петля». Кроме того, в большинстве своем они были эволюционно связаны между собой, одни более тесно (например, общие для C. elegans и C. briggsae), другие – менее. Необходимо отметить и важное отличие вновь идентифицированных 22-нуклеотидных РНК – они экспрессировались не на различных этапах развития, как РНК lin-4 и let-7, а в различных типах клеток. Таким образом, термин «микроРНК» использовался для обозначения малых временных РНК, а также других малых РНК с похожими свойствами, но неизвестными функциями [16-18]. Активно проводимые исследования в этом направлении позволили выявить множество дополнительных генов микроРНК млекопитающих, рыб, червей и мух [22][24-32]. Для того, чтобы упорядочить и облегчить обозначение вновь идентифицируемых генов и систематизировать данные об известных микроРНК, был создан регистр [23], на основе которого впоследствии была создана крупнейшая база данных последовательностей микроРНК miRBase (https://mirbase.org).

Номенклатура микроРНК имеет ряд правил [24], приведём в качестве примеров лишь некоторые из них. Так, префикс “miR”, за которым следует тире и число, отображает порядок наименования, причём “MiR” с заглавной буквы говорит о зрелой форме микроРНК, а с прописной – “mir” – пре-микро-РНК и при-микро-РНК [25]. Одинаковое число с добавлением буквы латинского языка отображает близость гомологов (например, miR-181a, miR-181b). Если же идентичные микроРНК закодированы в разных позициях генома, будет приписываться добавочное число через дефис (например, mir-2b-1, mir-2b-2). Принадлежность обозначается трехбуквенным префиксом (например, для человека – hsa (homo sapiens).

Большинство генов микроРНК, как и гены lin-4 и let-7 C. Elegans, относятся к участкам генома, которые находятся довольно далеко от ранее идентифицированных генов, что позволяет предположить, что они относятся к различным транскрибируемым единицам [16-18]. Кроме того, необходимо сказать, что небольшая часть (около четверти генов человеческой микроРНК) находятся в интронных участках пре-иРНК. Кроме того, синтезируемые микроРНК имеют ту же ориентацию и последовательность, что и итоговая мРНК, что позволяет предположить, что большинство этих микроРНК транскрибируются не с помощью своего собственного промотора, а подвергаются процессингу на основе интронов, что также можно видеть для многих ядрышковых РНК [28][32-36].

Другие гены микроРНК расположены в геноме и экспрессируются как мультицистронный первичный транскрипт* [12,13]. В отличие от животных, у которых гены микроРНК часто сгруппированы в кластеры и расположены внутри интронов белок-кодирующих генов, все гены микроРНК растений закодированы в межгенных спейсерах и кластеры образуют редко. При рассмотрении механизма образования и действия микроРНК необходимо подробнее остановиться на таком классе РНК, как малые интерферирующие РНК, а также на процессе РНК-интерференции в целом.

Этапы общепринятого биогенеза микроРНК представлены на рисунке 3. Преобладающее большинство генов микроРНК расположены в участках более крупных кодирующих белков; остальные – в межгенных областях генома. Гены микроРНК, как правило, транскрибируются с помощью РНК-полимеразы II. К полученному протяженному первичному транскрипту (при-микроРНК) присоединяется кэп, а затем подвергается полиаденилированию [1][38][39]. РНКаза типа III Drosha разрезает при-микроРНК на 60-70 белок-связывающих пре-микроРНК, имеющих в своей структуре комплекс «стебель-петля», которые транспортируются из ядра с помощью экспортина 5 и ГТФазу Ran, относящуюся к семейству Ras-подобных ГТФаз и служащую для сопряжения транспорта с гидролизом ГТФ, что придает процессу необратимость. В цитоплазме другая РНКаза типа III, Dicer, удаляет шпильку, оставляя двойную цепь микроРНК. Она из цепей микроРНК удаляется, оставляя вторую в качестве зрелой микроРНК. Предпочтение отдается тому фрагменту, 5'-конец которого конъюгирован менее прочно. Зрелая микроРНК перемещается в комплекс сайленсинга, индуцированный РНК (RISC), где последний направляет расщепление целевой РНК с помощью Argonaute 2 (Ago2) [40]. Позиционирование осуществляется за счет комплементарности нуклеотидов 2-8, 5’-конца микроРНК, с комплементарной последовательностью целевой мРНК.         

Рисунок 3. Биогенез и функция микроРНК. Механизм биосинтеза микроРНК. Описаны и иные варианты различных этапов биосинтеза микроРНК. Переработан и адаптирован [42][43]

Drosha, РНКаза типа III (эндонуклеаза); DGCR8, критическая область 8 синдрома ДиДжорджи; Dicer, другая РНКаза типа III (эндонуклеаза); RISC – комплекс сайленсинга, индуцированный РНК; Ago – Argonaute 2

Figure 3. Biogenesis and function of microRNA. Mechanism of microRNA biosynthesis. Other variants of various stages of microRNA biosynthesis are described as well. Adaptation and translation [42][43]

Drosha, RNase III (endonuclease); DiGeorge Syndrome Critical Region 8 (DGCR8); Dicer, another type RNase III (endonuclease); RISC – silencing complex induced by RNA; Ago – Argonaute 2

Эти целевые области обычно, но не всегда, расположены внутри 3’-нетранслируемой области мРНК. Важно отметить, что одна микроРНК, как правило, оказывает влияние на многие мРНК, а многие мРНК, в свою очередь, содержат участки, комплементарные нескольким микроРНК. Обычно регуляция с помощью микроРНК не носит характер «всё или ничего», а представляет собой тонкий механизм воздействия на уровень экспрессии генов. мРНК, белок и микроРНК тесно взаимосвязаны. Кроме того, есть много примеров, когда микроРНК косвенно изменяет экспрессию генов, подавляя экспрессию факторов транскрипции [41].

Важность процессинга и функционирования микроРНК широко изучается при заболеваниях различной этиологии (особенно в онкологии), в частности, в тех случаях, когда нарушается синтез и позиционирование микроРНК. Механизмы включают полиморфизмы 3’-нетранслируемой области целевой мРНК, препятствующие связыванию микроРНК, микроРНК-«ловушки», конкурентно связывающиеся со свободными местами связывания на белке, а также дефекты биогенеза микроРНК, отрицательно сказывающиеся на количестве последней [44-46].

В работе Mitchell и соавт. было установлено, что эндогенные микроРНК находятся и циркулируют в плазме человека [47]. Авторы инкубировали образцы человеческой плазмы крови при комнатной температуре в течение 24 часов, проводили несколько циклов замораживания-оттаивания и определяли экспрессию miR-15b, miR-16 и miR-24 с помощью количественной ПЦР. В отличие от мРНК, циркулирующие микроРНК характеризовались заметно большей стабильностью [48] и устойчивостью к деградации под действием эндогенных РНКаз [49][50]. Напротив, при введении синтетических микроРНК (соответствующие микроРНК C. elegans cel-miR-39, cel-miR-54, cel-miR-238) в человеческую плазму был зафиксирован быстрый распад в течение нескольких минут. При использовании денатурирующего раствора происходила инактивация РНКаз, что, в свою очередь, позволяло защитить экзогенные микроРНК от распада. Таким образом, можно сделать вывод о том, что нативные («незащищенные») микроРНК подвержены быстрому распаду в плазме, в то время как циркулирующие микроРНК защищены и устойчивы к действию РНКаз. В этой связи был выдвинут ряд гипотез. Циркулирующие микроРНК находятся в микровезикулах (экзосомах, микрочастицах (МЧ), апоптотических тельцах), в которых они выходят в плазму крови и которые обеспечивают защиту от активности РНКаз. Другие же исследования продемонстрировали, что после изоляции микровезикул и последующего высокоскоростного центрифугирования как среды культуры клеток [51, 52], так и плазмы [53-55], микроРНК по-прежнему определялись во взвеси, лишенной микровезикул, что, в свою очередь, могло свидетельствовать о существовании невезикулярных ассоциированных комплексов микроРНК-белок/липопротеин во внеклеточных средах (рис. 4).

Рисунок 4. Невезикулярные ассоциированные комплексы микроРНК-белок/липопротеин во внеклеточных средах [56]

Figure 4. Extracellular miRNA that can be secreted in association with extracellular vesicles or soluble protein complexe [56] 

Также циркулирующие микроРНК были выявлены и в других биологических жидкостях: в моче, семенной жидкости, слюне, грудном молоке [48][59-61].

Также в последнее время обсуждается биологический эффект экзогенных микроРНК (пища, грибы, бактерии), выявленных в кровотоке человека и попавших туда главным образом из кишечника [62].

В частности, рассматривается наличие особой роли экзогенных микроРНК в регуляции сердечно-сосудистой функции: так, при соблюдении определённой диеты наблюдается эффект кардиопротекции, который может быть результатом синергических эффектов как от эндогенных, так и экзогенных микроРНК (рис. 5) [63]. Также имеются данные о положительном терапевтическом эффекте включения в рацион питания пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени определённых фруктов и растительных компонентов, что приводило к изменению экспрессии исследуемых микроРНК [64].

Рисунок 5. Участие микроРНК в индуцированных диетой сердечно-сосудистых преимуществах [63]

Figure 5. Participation of miRNAs in diet-induced cardiovascular benefits [63]

Несмотря на то, что исследования микроРНК имеют довольно непродолжительную историю, уже весьма очевидна важность роли микроРНК в организме и ее влияние на большое количество процессов, протекающих в нем. Безусловно, микроРНК в ближайшие годы будет широко изучаться и дальше, ведь не остаётся сомнений в важности будущих исследований не только для более глубокого фундаментального понимания регуляции, опосредованной микроРНК, но и ее применения в диагностике и лечении различных заболеваний.